HITUNG TROMBOSIT

Menghitung Trombosit

Trombosit sukar dihitung karena mudah sekali pecah dan sukar dibedakan dengan kotoran kecil. Dan ditambah dengan sifatnya yang cenderung melekat pada permukaan asing (bukan endotel utuh) dan menggumpal-gumpal.

Ada dua cara yang lazim di pakai, yaitu cara langsung dan cara tidak langsung. pada cara tidak langsung jumlah trombosit dibandingkan dengan jumlah eritrosit, sedangkan jumlah eritrosit itulah yang sebnarnya dihitung. untuk mencegah trombosit melekat pada permukaan asing, dianjurkan untuk menggunakan alat-alat gelas yang dilapisi silikon atau alat-alat plastik

• Cara Langsung (Rees dan Ecker)

Darah diencerkan dengan larutan REES ECKER dan jumlah trombosit dihitung dalam kamar hitung. Larutan REES ECKER : natrium sitrat 3,8g; formaldehid 40% 2 ml; brillian cresylblue 30 mg; aquadest ad 100 ml. Harus disaring sebelum dipakai.

1. Isaplah larutan REES ECKER ke dalam pipet eritrosit samapi garis tanda “1″ dan buanglah lagi cairan itu.
2. Isaplah darah sampai garis tanda “0,5″ dan cairan REES ECKER sampai garis tanda “101″. Segeralah kocok selama 3 menit.
3. Teruskan tindakan seperti menghitung eritrosit dalam kamar hitung.
4. Biarkan kamar hitung yang telah terisi dalam sikap datar dalam cawan petri tertutup selama 10 menit agar trombosit mengendap
5. Hitunglah semua trombosit dalam seluruh bidang besar di tengah-tengah (1 mm kuadrat) memakai lensa objektif besar.
6. Jumlah itu dikalikan 2.000 menghasilkan jumlah trombosit per ul darah.

• Cara tidak langsung (Fonio)

1. Bersihkan ujung jari dengan alkohol dan biarkan kering lagi.
2. Taruhlah di atas ujung jari tersebut setetes besar larutan magnesium sulfat 14%.
3. Tusuklah ujung jari dengan lanset melalui tetesan lar magnesium sulfat tersebut.
4. Setelah jumlah darah keluar kurang lebih 1/4 jumlah larutan magnesium sulfat, campurlah darah dengan magnesium sulfat tersebut.
5. Buatlah sedian hapus (dengan pewarnaan Wrigth atau Giemsa)
6. Hitung jumlah trombosit yang dilihat bersama dengan 1.000 eritrosit.
7. Lakukanlah tindakan menghitung jumlah eritrosit per ul darah.
8. Perhitungkanlah jumlah trombosit per ul darah berdasarkan kedua angka itu.

Catatan : Jumlah trombosit dalam keadaan normal sangat dipengaruhi oleh cara menghitungnya. sering dipastikan nilai normal adalah antara 200.000 dan 500.000 per ul darah. Karena sukar dihitung, pemeriksaan semikuantitatif tentang jumlah trombosit dalam sediaan apus darah sangat besar artinya sebagai pemeriksaan penyaring.

 Latar belakang : Trombosit mempunyai peran penting pada pembentukan sumbat hemostasis. Penilaian trombosit meliputi jumlah dan fungsi. Metoda untuk pemeriksaan fungsi agregasi trombosit yang banyak dilakukan saat ini adalah TAT metoda nefelometrik, namun tidak semua laboratorium dapat mengerjakannya. Untuk mengatasi hal tersebut dilakukan percobaan pemeriksaan sediaan apus darah tepi untuk menilai fungsi agregasi trombosit yang dapat dikerjakan di semua laboratorium, tidak memerlukan alat khusus dan murah. Tinian : mengetahui kesesuaian hasil dan nilai diagnostik pemeriksaan sediaan apus darah tepi dibandingkan TAT metoda nefelometrik yang meliputi sensitivitas, spesifisitas, nilai ramal positip dan nilai ramal negatip. Bahan dan metoda : Dilakukan pemeriksaan sediaan apus darah tepi dan TAT metoda nefelometrik dad 65 subyek yang ada. Antikoagulan yang digunakan Natrium citrate 3,8 %. Sediaan apus dibuat sebelum dan setelah 3 menit pemberian induktor adrenalin 3pM Penilaian fungsi agregasi trombosit berdasarkan pembacaan pada zone VI daerah medial, lateral dan mediolateral. Dihitung banyaknya trombosit yang berkelompok dibandingkan total trombosit Hasil yang didapat dimasukkan ke rumus Velaskar. Hasil pemeriksaan sediaan apus dibandingkan dengan hasil TAT metoda nefelometrik dan dicari batas hipoagregasi, normoagregasi dan hiperagregasi dengan bantuan titik-titik kurva ROC. Dad hasil yang didapat dilakukan uji korelasi, uji beda t berpasangan dan uji diagnostik antara pemeriksaan sediaan apus darah tepi dan TAT metoda nefelometrik. Hasil penelitian : Didapatkan hasil batas bawah normoagregasi 54% dan batas atas nonnoagregasi 70%. Pada uji korelasi antara pembaca I dan TAT metoda nefelometrik didapatkan r=0,463; p=0,000 (pc0,01) dan path uji beda t berpasangan didapatkan p=-0,357 (p>0,05). Uji diagnostik pemeriksaan sediaan apus darah tepi dibandingkan TAT metoda nefelometrik untuk menentukan hipoagregasi atan tidak mempunyai sensitivitas 73,33%, spesifisitas 86,00%, nilai ramal positip 61,11% dan nilai ramal negatip 91,49%. Sedang untuk menentukan normoagregasi atau tidak mempunyai sensitivitas 57,89%, spesifisitas 60,42%, nilai ramal positip 39,29% dan nilai ramal negatip 78,38%. Untuk menentukan hiperagregasi atau tidak mempunyai sensitivitas 64,52%, spesifisitas 74,29%, nilai ramal positip 68,97% dan nilai ramal negatip 70,27%. Kesimpulan : Metoda sediaan apus darah tepi dapat dipakai untuk menilai fungsi agregasi trombosit seperti halnya TAT metoda nefelometrik. Kata anal : tes agregasi trombosit, nefelometrik, sediaan apus

PEMERIKSAAN JUMLAH TROMBOSIT DALAM DIAGNOSIS LABORATORIUM 

PENDAHULUAN 

Trombosit berasal dari fragmentasi sitoplasma megakariosit, suatu sel muda yang besar dalam sumsum tulang. Megakariosit matang ditandai proses replikasi endomiotik inti dan makin besarnya volume plasma, sehingga pada akhirnya sitoplasma menjadi granular dan terjadi pelepasan trombosit. Setiap megakariosit mampu menghasilkan 3000 - 4000 trombosit, waktu dari diferensiasi sel asal (stem cell) sampai dihasilkan trombosit memerlukan waktu sekitar 10 hari. Umur trombosit pada darah perifer 7-10 hari. 

Trombosit adalah sel darah tak berinti, berbentuk cakram dengan diameter 1 - 4 mikrometer dan volume 7 – 8 fl. Trombosit dapat dibagi dalam 3 daerah (zona), zona daerah tepi berperan sebagai adhesi dan agregasi, zona “sol gel” menunjang struktur dan mekanisme interaksi trombosit, zona organel berperan dalam pengeluaran isi trombosit. Fungsi utama trombosit adalah pembentukan sumbatan mekanis sebagai respon hemostatik normal terhadap luka vaskuler, melalui reaksi adhesi, pelepasan, agregasi dan fusi serta aktivitas prokoagulannya. Nilai normal trombosit bervariasi sesuai metode yang dipakai. Jumlah trombosit normal menurut Deacie adalah 150 – 400 x 109 / L. Bila dipakai metode Rees Ecker nilai normal trombosit 140 – 340 x 109/ L, dengan menggunakan Coulter Counter harga normal 150 – 350 x 109/L. 

Dalam tulisan ini akan dibahas mengenai bahan pemeriksaan yang digunakan dalam pemeriksaan trombosit dalam laboratorium dan kelainan trombosit yang mungkin terjadi. 

BAHAN PEMERIKSAAN 

Bahan pemeriksaan adalah darah lengkap, yang dapat diperoleh dari darah kapiler atau darah vena. Darah Kapiler Pengambilan darah kapiler untuk orang dewasa dilakukan pada ujung jari tangan ketiga dan keempat serta pada anak daun telinga, sedangkan pada bayi dan anak-anak biasanya diambil dari tumit atau ibu jari kaki. 

Perlu diperhatikan dalam pengambilan sampel darah kapiler adalah sebelum penusukan dimulai keadaan setempat perlu diperhatikan dengan seksama, merupakan kontra indikasi adalah adanya bekas-bekas luka, keradangan, dermatitis ataupun oddema. Pengambilan darah kapiler dapat dilakukan bila jumlah darah yang dibutuhkan sedikit saja, atau dalam keadaan emergency, karena selain jumlah darah yang diambil sedikit sehingga jika terjadi kesalahan dalam pemeriksaan akan sulit untuk menanggulangi. 

Kesulitan-kesulitan yang sering terjadi dalam pengambilan sampel darah ini adalah, apabila kulit sekitar luka tusukan tidak kering karena alkohol atau keringat, maka tetesan darah yang keluar tidak dapat mengumpul melainkan menyebar ke sekitarnya sehingga sukar untuk mengambilnya. Lagipula bahan darah semacam ini tidak boleh digunakan karena sudah bercampur dengan bahan lain. 

Darah tidak dapat keluar dengan lancar. Hal ini biasanya karena penusukan yang kurang dalam atau peredaran darah setempat kurang baik. Usaha untuk melancarkan pengeluaran darah dengan memijat akan sia-sia karena darah yang keluar tidak dapat dipergunakan karena sudah tercampur dengan cairan jaringan sehingga hasil pemeriksaan menunjukkan hasil yang lebih rendah dari yang sebenarnya. 

Darah Vena Pengambilan darah vena untuk orang dewasa dilakukan pada vena difossa cubiti, sedangkan pada anak-anak atau bayi bila perlu, darah diambil dari vena jugularis eksterna, vena femoralis bahkan dapat diambil dari sinus sagittalis superior. Pengambilan darah vena perlu dilakukan dengan hati-hati karena bahaya yang dapat terjadi jauh lebih besar daripada pengambilan darah kapiler. 

Dalam pengambilan sampel darah vena perlu diperhatikan, tempat yang akan digunakan untuk pengambilan harus diperiksa dengan seksama antara lain letak dan ukuran vena. 

PEMERIKSAAN JUMLAH TROMBOSIT

Pemeriksaan hitung jumlah trombosit dalam laboratorium dapat dilakukan secara langsung maupun tidak langsung. Secara langsung menggunakan metoda Rees Ecker, metoda Brecher Cronkite dan Cell Counter Automatic Metode Rees Ecker. Darah diencerkan dengan larutan BCB (Brilliant Cresyl Blue), sehingga trombosit akan tercat terang kebiruan. Trombosit dihitung dengan bilik hitung di bawah mikroskop, kemungkinan kesalahan metode Rees Ecker 16-25%. Metode Brecher Cronkite Darah diencerkan dengan larutan amonium oksalat 1% untuk melisiskan sel darah merah, trombosit dihiotung pada bilik hitung menggunakan mikroskop fase kontras. Kemungkinan kesalahan Brecher Cronkite 8-10%. Metode Cell Counter Automatic Metode ini menggunakan prinsip flow cytometri. Prinsip tersebut memungkinkan sel-sel masuk flow chamber untuk dicampur dengan diluent kemudian dialirkan melalui apertura yang berukuran kecil yang memungkinkan sel lewat satu per satu. Aliran yang keluar dilewatkan medan listrik untuk kemudian sel dipisah-pisahkan sesuai muatannya. Teknik dasar pengukuran sel dalam flow cytometri ialah impedansi listrik (electrical impedance) dan pendar cahaya (light scattering). Teknik impedansi berdasar pengukuran besarnya resistensi elektronik antara dua elektrode. Teknik pendar cahaya akan menghamburkan, memantulkan atau membiaskan cahaya yang berfokus pada sel, oleh karena tiap sel memiliki granula dan indek bias berbeda maka akan menghasilkan pendar cahaya berbeda dan dapat teridentifikasi. Pada cell counter automatic masih terdapat kelemahan apabila ada trombosit yang bergerombol, trombosit besar (giant) serta adanya kotoran, pecahan eritrosit, pecahan leukosit sehingga cross check menggunakan sediaan apus darat tepi (SADT) sangat berarti. Sedangkan hitung rombosit secara tidak langsung menggunakan metode Fonio dan melakukan estimasi metode Barbara Brown Metode Fonio Metode ini dilakukan dengan menggunakan darah kapiler pada ujung jari dicampur dengan larutan magnesium sulfat 14% kemudian dibuat SADT dan dilakukan pengecatan giemsa. Jumlah trombosit dihitung dalam 1000 eritrosit, jumlah mutlak trombosit dapat diperhitungkan dari jumlah mutlak eritrosit. Cara ini lebih kasar daripada cara langsung. 

Estimasi Jumlah Trombosit Pada SADT 

Pada prinsipnya semua hasil hitung trombosit baik normal maupun abnormal yang diperiksa secara langsung harus dilakukan cross check dengan SADT. Cross check pada SADT bertujuan untuk mengetahui ada tidaknya perbedaan antara hitung trombosit secara langsung dan estimasi. Perbedaan mencolok antara hitung trombosit secara langsung dan estimasi dapat disebabkan oleh 3 faktor : 

1. Faktor pranalitik. 

Misalnya : 

§ sampel tertukar 

§ cara sampling yang tidak benar 

§ kesalahan mencantumkan identitas 

2. Faktor analitik 

Misalnya : cara pembuatan SADT yang tidak memenuhi syarat kesalahan alat hitung yang dipakai 

3. Faktor post analitik, biasanya terjadi saat penulisan hasil. 

SADT untuk estimasi jumlah trombosit harus dibuat sebaik mungkin, sehingga terbentuk daerah baca yang baik. Trombosit harus terdistribusi rata dan tidak menggerombol, apabila trombosit cenderung bergerombol harus dibuat SADT baru dengan cara terlebih dahulu mencampur sampel darah secara baik 

Berdasarkan susunan populasi sel darah merah SADT dibagi menjadi 6 zona, yaitu : 

• Zona I disebut zona irreguler, di daerah ini sel darah merah tidak teratur dan kadang ada yang padat bergerombol. Daerah ini meliputi kira-kira 3% dari seluruh badan SADT. 

• Zona II disebut zona tipis, dimana distribusi sel darah merah tidak teratur, saling berdesakan dan bertumpuk. Zona ini meliputi sekitar 14%. 

• Zona III disebut zona tebal, dimana sel-sel darah merah bergerombol dan padat luas zona ini sekitar 45% atau hampir separo dari badan SADT. 

• Zona IV disebut juga zona tipis, yang sama kondisinya dengan zona II hanya lebih tipis. Luasnya sekitar 18% dari SADT. 

• Zona V, zona reguler merupakan tempat sel-sel tersebar rata tidak saling bertumpuk dan bentuk-bentuknya masih asli. Daerah ini meliputi sekitar 11% dari badan SADT. 

• Zona VI juga disebut zona sangat tipis, terletak di ujung sediaan apus sebelum ekor. Di sini sel-sel lebih longgar dan umunya berderet. Zona ini luasnya sekitar 9% dari badan SADT. Metoda estimasi menurut Barbara Brown, apabila pada zona V dengan pembesaran lensa obyektif 100 kali ditemukan 1 trombosit maka dikalikan dengan 20.000. Faktor perkalian (f) menurut Barbara Brown adalah 20.000. 

KELAINAN TROMBOSIT.Kelainan trombosit meliputi kuantitas dan kualitas trombosit. Trombositopeni Trombositopeni adalah berkurangnya jumlah trombosit dibawah normal, yaitu kurang dari 150 x 109 / L. Trombositopeni dapat terjadi karena beberapa keadaan : 

• Penurunan produksi (megakariositopeni), terjadi bila fungsi sumsum tulang terganggu . 

• Meningkatnya destruksi (megakariositosis), terjadi akibat trombosit yang beredar berhubungan dengan mekanisme imun. 

• Akibat pemakaian yang berlebihan (megakariositosis), misalnya pada DIC (Disseminated Intravasculer Coagulation), kebakaran, trauma. 

• Pengenceran trombosit. 

• Dapat terjadi oleh karena tranfusi yang dibiarkan dalam waktu singkat dengan memakai darah murni yang disimpan sehingga dapat mengakibatkan kegagalan hemostatik pada resipien. 

Trombositosis 

Trombositosis adalah meningkatnya jumlah trombosit pada peredaran darah diatas normal, yaitu lebih dari 400 x 109 / L. Pada trombositosis apabila rangsangan-rangsangan yang menyebabkan trombositosis ditiadakan maka jumlah trombosit kembali normal, misalnya terjadi pada perdarahan yang akut, contohnya pada trauma waktu pembedahan atau melahirkan. 

Trombositemi 

Trombositemi yaitu peningkatan jumlah trombosit oleh proses yang ganas. Misalnya pada lekemia mielositik kronik. Jumlah trombosit pada trombositemi dapat melebihi 1.000x109/L. 

Kelainan Kualitas Trombosit 

TrombositopatiTrombositopati adalah keadaan yang menggambarkan kelainan trombosit terutama yang melibatkan “platelet faktor 3” dan selanjutnya pembentukan tromboplastin plasma. Hal ini dapat disebabkan oleh kelainan bawaan / didapat. 

DAFTAR PUSTAKA 

Indriastuti EC, Lisyani S, Tjahjati MI. Perbedaan jumlah agregat trombosit pada sediaan apus darah tepi mahasiswa FK Undip semester IV sebelum dan setelah periode ujian semester. Dipresentasikan pada PIT I PDS Patklin & Konker IX HKKI di Surakarta, 20 – 22 September 2002. 

Hoffbrand AV, Petit JE. Trombosit, pembekuan darah dan hemostasis. Dalam : Hoffbrand AV, Petit JF eds. Essential haematology. Terjemahan : Darmawan I. Ed 2. Jakarta. Penerbit buku kedokteran EGC, 1987 : 201 – 18.

Stenberg PE, Hill RJ. Platelets and megakaryocites. In : Lee GR, Foerster J, Greer JP, Rodgers GM, Lukens J, Paraskev F eds. Wintrobe’s clinical hematology. 10th ed. Baltimore. William & Wilkins, 1999 : 615 – 60. 

Julius S. Platelet Pathobiology. Yale University – section of cardiovascular medicine. Available from http://info.med.yale.edu/ysm, 1999. 

Sotianingsih. Uji diagnostik pemeriksaan sediaan apus darah tepi dalam menilai fungsi agregasi trombosit. Dipresentasikan pada pertemuan PHTDI di Semarang, 2001. 

Dacie JV, Lewis SM. Collection and handling of blood. In : John VD, SM Lewis eds. Practical Haematology. 7th ed. Singapura. Churchill Livingstone, 1991 : 1 – 8. 

Sastroasmoro S, Ismael S. Dasar – dasar metodologi penelitian klinis. Jakarta . Sagung Seto, 2002. 

Dacie JV, Lewis SM. Preparation and staining methods for blood and bone marrow. In : John VD, SM Lewis eds. Practical Haematology. 7th ed. Singapura. Churchill Livingstone, 1991 : 75 – 89. 

Narayanan S. The preanalytic phase. An important component of laboratory medicine. Am J Clin Path 2000; 113. 

Budiwiyono I. Prinsip pemeriksaan preparat hapus darah tepi. Dalam : Imam BW, Purwanto AP ed. Workshop Hematologi III. Keganasan hematologik. Pembacaan preparat darah hapus (Workshop Hematologi III). Semarang. Bagian PK FK Undip, 1995 : 19 – 26.